Научное исследование получения лечебной концентрации тромбоцитов в плазмотерапии
Получении плазмы, обогащенной тромбоцитами
Цель исследования
Определить оптимальные технологические режимы для приготовления аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами PRP – platelet-rich plasma, при использовании стандартного лабораторного оборудования.Материал и методы
Забор крови для исследования осуществлялся у 25 здоровых добровольцев. Ее центрифугирование проводили на стандартной лабораторной центрифуге СМ-6М с использованием различных режимов и двух видов вакуумных пробирок с литий-гепарином, содержащих сепарационный гель, и без него. Количество тромбоцитов и лейкоцитов подсчитывали в верхнем, нижнем и среднем слоях полученного образца плазмы.Результаты
Оптимальными по количеству тромбоцитов являются образцы плазмы при режимах центрифугирования от 415 до 1660 g в течение 10 мин с использованием пробирок, не содержащих сепарационный гель. Забор плазмы из нижнего слоя полученного образца после центрифугирования всегда сопровождается включением в ее состав лейкоцитов, что может приводить к нежелательным тканевым реакциям при ее применении.Заключение
Для получения PRP возможно использование стандартного лабораторного оборудования при режиме центрифугирования от 415 до 1660 g в течение 10 мин с использованием пробирок, не содержащих сепарационный гель. Забор плазмы для клинического применения следует проводить из среднего слоя полученного образца.Введение
Развитие клеточных технологий и поиски эффективных методов стимуляции регенеративных процессов привели к изучению свойств аутологичной плазмы, насыщенной тромбоцитами, или Platelet Rich Plasma - PRP, которая впервые изучена в Калифорнийском университете в 1965 г. Ученые обнаружили, что из α-гранул тромбоцитов в случае их разрушения и активации в плазму выделяются различные биоактивные вещества, включая фактор роста тромбоцитов PDGF, трансформирующий фактор роста бета TGF-β и эпидермальный фактор роста EGF. Данные факторы содержатся в раневых экссудатах, способствуют пролиферации и ангиогенезу на ранних стадиях процесса заживления, а также являются ключевыми сигналами в восстановлении и регенерации тканей.В настоящее время имеется достаточная доказательная база и научное обоснование применения PRP при лечении различных заболеваний. PRP с успехом используется в клинической практике косметологов, стоматологов, ортопедов-травматологов, урологов, общих хирургов и во многих других областях медицины. Несмотря на все более широкое использование PRP в терапевтических целях, ее клинические эффекты весьма разнообразны. PRP может стимулировать пролиферацию дермальных фибробластов человека и увеличивать синтез коллагена I типа in vitro. Кроме того, согласно гистологическим данным, PRP при введении в глубокую дерму и непосредственно подкожную клетчатку вызывает активацию фибробластов и отложение нового коллагена, а также образование новых кровеносных сосудов и жировой ткани. PRP используется в регенеративной медицине для лечения язв, заболеваний опорно-двигательной системы, а также для восстановления тканей после операции, улучшения кровообращения при хронических ранах, связанных с невропатиями и сосудистыми заболеваниями. Еще одно применение PRP – это лечение послеожоговых, послеоперационных рубцов и рубцов от угревой сыпи.
Препараты PRP, полученные при помощи разных технологий, различаются по качественному и количественному составу компонентов. В зависимости от количественного содержания в препаратах лейкоцитов и фибрина их можно разделить на 4 группы:
- чистая обогащенная тромбоцитами плазма крови P-PRP – Pure Platelet Rich Plasma;
- обогащенная лейкоцитами и тромбоцитами плазма крови L-PRP – Leucocyte and Platelet Rich Plasma;
- чистый обогащенный тромбоцитами фибрин P-PRF – Pure Platelet Rich Fibrin;
- обогащенный лейкоцитами и тромбоцитами фибрин L-PRF – Leucocyte and Platelet Rich Fibrin.
Кровь для исследования забирали в вакуумные пробирки в объеме 5 мл из локтевой вены у здоровых добровольцев. Для сепарации форменных элементов крови в пробирке применяли стандартную лабораторную центрифугу СМ-6М. Всего проведено 65 исследований концентрации тромбоцитов в полученных образцах плазмы. В группу 1 вошли 45 исследований, проведенных с использованием вакуумных пробирок 13×100 мм с литий-гепарином. При этом все они были разделены на 3 подгруппы по 15 пробирок в зависимости от режима центрифугирования. В 1-й подгруппе применялся режим 1000 об. /мин в течение 5 мин, что для центрифуги СМ-6М соответствовало центробежной силе в 184 g. Во 2-й подгруппе центрифугирование осуществляли со скоростью 1500 об. /мин 415 g в течение 10 мин. В подгруппе 3 применялся режим 3000 1660 g об. /мин в течение 10 мин. Выбор режимов центрифугирования подбирали эмпирически. В группе сравнения кровь забирали в 20 вакуумных пробирок 13×100 мм, содержащих помимо литий-гепарина сепарационный гель. Режим центрифугирования для группы сравнения был выбран со скоростью 2000 об. /мин 738 g в течение 10 мин, так как данный режим рекомендован производителем для получения PRP. После окончания центрифугирования визуально разделяли плазму на верхний, средний и нижний слой и отбирали по 800 мкл из каждого слоя в трех независимых пробах рис. 1.
Образцы окрашивали по Паппенгейму, считали количество тромбоцитов и лейкоцитов до центрифугирования и в каждом выборочных из слоев после центрифугирования. Подсчет клеточных элементов крови проводился в камере Горяева и по методу Фонио, в дальнейшем вычислялся интегральный показатель по двум методам.
Статистическую обработку результатов исследования выполняли с помощью программы Med Calc Statistical Software Бельгия. Характер распределения значений оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Поскольку все вариационные ряды продемонстрировали нормальное распределение, результаты представлены в виде среднего арифметического значения и ошибки выборочного среднего M ± m. Достоверность различия выборочных средних оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Нулевая гипотеза отвергалась при значении порога доверительной вероятности р <0, 05.
Рисунок 1. Области для отбора проб обогащенной тромбоцитами плазмы после центрифугирования образцов
Результаты
Среднее количество тромбоцитов в цельной крови, полученной из венозной крови человека для исследования, в 1-й группе составило 273, 2 ± 15, 8 тыс./мкл, что соответствовало нормальным показателям содержания тромбоцитов в периферической крови человека. Во всех подгруппах после применения различных режимов центрифугирования терапевтической концентрации тромбоцитов в верхних слоях образцов не зарегистрировано, количество тромбоцитов определялось в пределах от 175, 3 ± 9, 3 до 401, 6 ± 22, 7 тыс./мкл. После проведения первого режима центрифугирования со скоростью 1000 об. /мин. 184 g в течение 5 мин. содержание тромбоцитов в верхнем слое образца плазмы составило 401, 6 ± 25, 3 тыс./мкл, в среднем слое – 891, 8 ± 37, 2 тыс./мкл, в нижнем слое – 1136, 1 ± 44, 4 тыс./мкл рис. 2.
Рисунок 2. Концентрация тромбоцитов в образцах плазмы 1й группы
р <0, 05 относительно показателей для верхнего слоя внутри подгруппы; р <0, 05 относительно показателей для верхнего слоя между подгруппами; среднее арифметическое от медианных значений количества тромбоцитов по Фонио и при их подсчете в камере Горяева.
Наибольшую концентрацию тромбоцитов в нижнем слое образца плазмы – 1723, 5 ± 125, 4 тыс./мкл. удалось получить при проведении второго режима центрифугирования со скоростью 1500 об. /мин 415 g в течение 10 мин. При этом в среднем слое образца также отмечалась достаточно высокая концентрация тромбоцитов, чтобы считать эту плазму обогащенной – 1002, 9 ± 77, 1 тыс./мкл. В результате центрифугирования образцов плазмы подгруппы 3 в режиме 3000 1660 g об. /мин в течение 10 мин получены наибольшие показатели концентрации тромбоцитов в среднем слое образца – 1351, 7 ± 96, 3 тыс./мкл. Статистически достоверной разницы в этих случаях между средним и верхним слоем, концентрация тромбоцитов в котором составила 1601, 9 ± 113, 6 тыс./мкл, не выявлено р = 0, 041.
Наименьшее количество примесей в виде лейкоцитов определено в верхних и средних слоях образцов плазмы – от 0, 3 до 0, 6 тыс./мкл. рис. 3. В нижних слоях плазмы во всех случаях определялась высокая концентрация лейкоцитов в пределах от 1, 9 до 5, 2 тыс./мкл.
Среднее количество тромбоцитов цельной крови перед центрифугированием пробирок из группы 2 составило 273, 2 ± 19, 8 тыс./мкл.
При центрифугировании пробирок, содержащих сепарационный гель, в режиме 2000 об./мин 738 g. в течение 10 мин нам не удалось добиться терапевтической концентрации тромбоцитов ни в одном случае. Среднее содержание тромбоцитов в верхнем слое образца плазмы составило 23, 1 ± 1, 4 тыс./мкл, в нижнем слое – 210, 1 ± 12, 2 тыс./мкл. При этом в верхнем слое плазмы примеси в виде лейкоцитов не обнаружены вообще, в нижнем слое образца концентрация лейкоцитов составила 0, 1 ± 0, 05 тыс./мкл.
Рисунок 3. Концентрация лейкоцитов в образцах плазмы 1-й группы
Обсуждение
Концентрации тромбоцитов и лейкоцитов в образцах плазмы, полученных при разных режимах центрифугирования, имеют существенные различия. Показатели количества тромбоцитов в нижних слоях плазмы в группах 1 и 2 соответствуют данным исследования, в котором использовались пробирки без сепарационного геля и с ним, а также специализированные пробирки для получения PRP. При этом в данной работе нет сведений об алгоритме отбора проб плазмы и ее количестве для анализа.Существуют данные о методиках, которые позволяют получить концентрацию тромбоцитов более 2500 тыс./мкл., с применением больших объемов плазмы и двойного центрифугирования, что не удалось достичь в нашей работе. В то же время есть мнение, что важное значение имеет не столько концентрация тромбоцитов, сколько их целостность. Доказано, что количество выделяемых факторов роста не коррелирует с концентрацией тромбоцитов в PRP, а скорость их высвобождения выше в гелеобразных образцах плазмы. Кроме того, ряд авторов указывают, что при очень высокой концентрации тромбоцитов возможен также процесс аутоактивации и парадоксальный ингибирующий эффект PRP на процессы регенерации.
Кроме того, во многих работах описано применение специализированных устройств для получения PRP, но их использование предусматривает неизбежно высокое содержание лейкоцитов в получаемых препаратах в среднем от 11, 0 до 27, 3 тыс. клеток в мкл., что не соответствует полученным нами данным. Существуют противоречивые точки зрения на влияние примесей в PRP. Присутствие лейкоцитов в плазме, обогащенной тромбоцитами, предположительно оказывает положительный эффект в связи с их антибактериальной активностью, но имеющийся воспалительный потенциал лейкоцитов, содержащихся в плазме, может существенно повлиять на течение раневого процесса в целом. При получении собственных образцов PRP мы старались минимизировать количество лейкоцитарных примесей для профилактики развития возможных про воспалительные процессы.
Разнообразие методов получения препаратов PRP является причиной отсутствия стандартизации технологий и качества оценки результатов их применения. В большинстве отечественных и зарубежных источников методы получения PRP путем центрифугирования цельной крови описываются техническими характеристиками, включающими число оборотов центрифуги в минуту и время проведения центрифугирования, например, 3600 об./мин в течение 10 мин или 2300 ± 140 об./мин в течение 14 мин. Следует отметить, что использование показателя числа оборотов в минуту для сравнения полученных результатов у разных авторов и на разном оборудовании теряет смысл так как значения центробежной силы, благодаря которой и осуществляется процесс сепарации клеток крови при центрифугировании, напрямую зависят не только от количества оборотов в минуту, но и от радиуса центрифуги, и будут различаться друг от друга.
Выбранный нами наиболее оптимальный режим – 1500 об. /мин 415 g в течение 10 мин, возможно, предотвращает разрушение стенок тромбоцитов, так как количество поврежденных клеток напрямую зависит от скоростных параметров и времени проведения процедуры. Известно также, что при ускорении 400 g спонтанная активация тромбоцитов составляет 5%. В настоящее время нет данных об изучении соотношения числа целых и разрушенных тромбоцитов в образцах плазмы, полученных при разных режимах центрифугирования. Некоторые авторы сообщают о выраженном клиническом эффекте применения плазмы с содержанием тромбоцитов, в 1, 5 – 2 раза превышающим базовую концентрацию, при доказанной целостности клеток по данным электронной микроскопии. Имеются данные о клинически эффективных образцах плазмы с концентрацией тромбоцитов ниже 106/мкл., полученные при малых значениях центробежной силы и однократном центрифугировании, что позволяет рассматривать возможность применения предложенных нами режимов в практике лечебных учреждений.
Стоит отметить, что использование пробирок с литий-гепарином и сепарационным гелем при режиме центрифугирования 738 g в течение 10 мин позволило получить обедненную тромбоцитами плазму и минимизировать количество лейкоцитарных примесей в образце. Полученный результат может быть обусловлен связыванием тромбоцитов с тиксотропным гелем, являющимся полимером и обладающим высокой вязкостью.
